Aufkommende Gemeinschaftsarchitektur trotz ausgeprägter Diversität im globalen epidermalen Mikrobiom des Walhais (Rhincodon typus).

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12747 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mikrobiome verleihen ihrem Wirt vorteilhafte physiologische Eigenschaften, die mikrobielle Vielfalt ist jedoch von Natur aus variabel, was die Beziehung zwischen Mikroben und ihren Beitrag zur Gesundheit des Wirts in Frage stellt. Hier vergleichen wir die Vielfalt und architektonische Komplexität des epidermalen Mikrobioms von 74 einzelnen Walhaien (Rhincodon typus) in fünf Ansammlungen weltweit, um festzustellen, ob Netzwerkeigenschaften möglicherweise eher auf die Beziehung zwischen Mikrobiom und Wirt hinweisen. Unter der Annahme, dass Mikroben voraussichtlich weltweit biogeografische Muster aufweisen und dass entfernt verwandte Mikrobengruppen ähnliche Funktionen erfüllen können, stellten wir die Hypothese auf, dass Mikrobiom-Koexistenzmuster unabhängig von Diversitätstrends auftreten würden und dass Schlüsselmikroben von Standort zu Standort unterschiedlich sein würden. Wir fanden heraus, dass die Ansammlung von Walhaien der wichtigste Faktor bei der Unterscheidung taxonomischer Diversitätsmuster war. Darüber hinaus war die Mikrobiom-Netzwerkarchitektur in allen Aggregationen ähnlich, wobei die Gradverteilungen mit Netzwerken vom Erdos-Renyi-Typ übereinstimmten. Die vom Mikrobiom abgeleiteten Netzwerke weisen jedoch Modularität auf, was auf eine eindeutige Mikrobiomstruktur auf der Epidermis von Walhaien hinweist. Darüber hinaus beherbergten Walhaie 35 hochwertige metagenomassemblierte Genome (MAGs), von denen 25 an allen Probenorten vorhanden waren, was als reichlich vorhandener „Kern“ bezeichnet wird. Es bildeten sich zwei Haupt-MAG-Gruppen, die hier als Ökogruppe 1 und 2 definiert werden, basierend auf der Anzahl der in Stoffwechselwegen vorhandenen Gene, was darauf hindeutet, dass es im Walhai-Mikrobiom mindestens zwei wichtige Stoffwechselnischen gibt. Obwohl die Variabilität der Mikrobiomvielfalt hoch ist, sind Netzwerkstruktur und Kerntaxa daher inhärente Merkmale des epidermalen Mikrobioms bei Walhaien. Wir schlagen vor, dass die Wirt-Mikrobiom- und Mikroben-Mikroben-Interaktionen, die die Selbstorganisation des Mikrobioms vorantreiben, dazu beitragen, einen funktionell redundanten, reichlich vorhandenen Kern zu unterstützen, und dass Netzwerkeigenschaften berücksichtigt werden sollten, wenn Mikrobiome mit der Gesundheit des Wirts verknüpft werden.

Für eukaryotische Organismen sind die verschiedenen Arten, aus denen sich ihre Mikrobiome zusammensetzen, mehr als nur Passagiere1: Sie beeinflussen Stoffwechsel- und Immunprozesse2 und übertragen physiologische Funktionen, die über die angeborenen Fähigkeiten des Wirts hinausgehen, und fördern so die Gesundheit3, 4. Diese Dienste resultieren aus einer Vielzahl von Interaktionen zwischen Mikroben und Wirt Zellen, die sich im Laufe der Zeit etablieren5. Dennoch sind die Artenzusammensetzung und -vielfalt des Mikrobioms räumlich und zeitlich und zwischen Individuen ähnlicher Arten sehr unterschiedlich6, oft ohne erkennbare Konsequenzen für den Wirt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Funktion oder die Leistungen des Mikrobioms nicht einfach auf das Vorhandensein oder die Häufigkeit einzelner Arten zurückzuführen sind7. Die Selbstorganisation oder das Interaktionsnetzwerk von Mikrobiomgemeinschaften ist eine Erklärung dafür, wie konsistente Dienste zur Unterstützung gesunder Mikrobiome aufrechterhalten werden8. Ob Wirtsmikrobiome jedoch eine entstehende Struktur aufweisen, bleibt eine offene Frage.

Selbstorganisation des Mikrobioms bezieht sich auf das kollektive Verhalten der mikrobiellen Mitglieder, das als Populationsmuster von mikrobiellen Gruppen relativ zueinander erfasst wird und als Koexistenz beschrieben wird: ein Muster, das als Mikrobiomarchitektur bezeichnet wird. Architektonische Eigenschaften (d. h. die Anzahl der Knoten und zugehörigen Kanten oder die Anzahl der durch interagierende Mikroben gebildeten Cluster) des Mikrobioms entstehen als Reaktion auf ökologische und evolutionäre Prozesse9, die die Wirt-Mikroben- und Mikroben-Mikroben-Interaktionen7 beeinflussen. Zusammengenommen steuern diese ökoevolutionären Prozesse die Populationsdynamik dieser Mikroben, was zu den architektonischen Eigenschaften des Mikrobioms führt. Daher kann die Neuordnung mikrobieller Populationen später neu entstehende Ökosystemfunktionen verändern10. Da Netzwerke von Natur aus hierarchisch sind11, kann die Quantifizierung der verschiedenen Attribute dieser Ebenen, wie Netzwerkkomplexität, Modularität und Interaktionen einzelner mikrobieller Gruppen, wichtige ökologische Erkenntnisse liefern, die die Gemeinschaftsstruktur bestimmen12. Beispielsweise führen Schwankungen der architektonischen Komplexität des Mikrobioms als Reaktion auf unterschiedlichen abiotischen Stress zu Veränderungen der Eigenschaften neu entstehender Gemeinschaften8, während mikrobielle Organismen, die Subnetzwerke bilden, auf ähnliche Umweltpräferenzen hinweisen13, 14. Es wird vorhergesagt, dass Mikroben mit vielen Verbindungen zu anderen mikrobiellen Gruppen wichtig sind in der Nischenbildung und gelten als Schlüsselorganismen15. Aus diesen Gründen ist die Bestimmung der Netzwerkarchitektur des Mikrobioms von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Struktur und Funktion des Mikrobioms.

In dieser Studie untersuchen wir epidermale Mikrobiome bei Walhaien (Rhincodon typus), um unsere Hypothese zu testen, dass die Wirt-Mikrobiom-Beziehung auf der Selbstorganisation der Mikrobiommitglieder für erforderliche Funktionen beruht und nicht von bestimmten taxonomischen Gruppen abhängig ist. Walhaie sind aus folgenden Gründen ein ideales Nicht-Modell-Wirtssystem, um diese grundlegende Mikrobiom-Zusammensetzungshypothese zu berücksichtigen: (1) Sie sind Teil der alten, noch existierenden Wirbeltierlinie der Chondrichthy-Fische, was sie an einem entscheidenden evolutionären Punkt für das Verständnis der Wirbeltiere platziert wirtsassoziierte Mikrobiombeziehung; (2) Sie sind eine der wenigen Tierarten, die weltweit verbreitet sind und tropische/subtropische Gewässer zwischen 30° nördlicher Breite und 35° südlicher Breite bewohnen16; und (3) diese Tiere bilden vorhersehbare saisonale Ansammlungen an bestimmten Standorten und nutzen dabei die Planktonblüten. Mithilfe der zufälligen Shotgun-Metagenomik haben wir die Mikrobiomarchitektur der Epidermis von 74 einzelnen Walhaien quantifiziert, die auf fünf Ansammlungen auf der ganzen Welt verteilt sind und sich über alle größeren Meeresbecken erstrecken. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Diversität und Zusammensetzung des Mikrobioms mit der Aggregation korrespondiert; Allerdings ist die Mikrobiomarchitektur ein grundlegendes Merkmal des epidermalen Mikrobioms auf der ganzen Welt. Darüber hinaus wurden zahlreiche Mitglieder des Kernmikrobioms, die als Metagenome Assembled Genomes (MAGs) identifiziert wurden, auf der Grundlage potenzieller Genfunktionen in zwei Hauptgruppen eingeteilt, die als Ökogruppe 1 und 2 bezeichnet werden, was mindestens zwei unterschiedliche ökologische Nischen innerhalb des epidermalen Mikrobioms aufdeckt. Wir gehen davon aus, dass diese unterschiedlichen Funktionen wichtige Stoffwechselprozesse unterstützen, die zur Stabilisierung der Mikrobiomarchitektur des Walhais beitragen können.

Epidermale Mikrobiome wurden von der dorsolateralen Hautoberfläche in Übereinstimmung mit der ersten Rückenflosse von 74 Walhaien in fünf weltweit verteilten Ansammlungen gesammelt (Abb. 1; SI-Tabelle 1). Die mittlere Bibliotheksgröße reichte von 335.820 (± 46.523) Lesevorgängen in Cancun bis 701.829 (± 70.068) in Ningaloo (SI Abb. 1a; SI Tabelle 1). Der Anteil der Lesevorgänge mit taxonomischen Zuordnungen war in Ningaloo am niedrigsten (Taxa: 16,5 % ± 1,5 %) und auf den Philippinen am höchsten (54,4 ± 1,5 %) (SI Abb. 1b).

Der Standort und die Probenahmemethoden zur Analyse des Hautmikrobioms von Walhaien. Die Probenstandorte stammen aus einer global verteilten Aggregation und sind durch farbige Punkte gekennzeichnet. Einfügungen zeigen, wie die Probenahme durchgeführt wurde und wie die Zwei-Wege-Spritze steriles Meerwasser über die Hautoberfläche der Walhaie spült und so das epidermale Mikrobiom von der umgebenden Wassersäule isoliert.

Die 20 relativ häufigsten Mikrobenfamilien machten 66 bis 82 % der gesamten proportionalen Häufigkeit aus (Abb. 2a). Zu den proportional häufig vorkommenden Familien gehörten Alteromonadaceae (maximal: Cancun-Mittelwert 18,7 ± 2,9 % – min: Philippinen 7,8 ± 1,7 %), Flavobacteriaceae (maximal: Cancun 16,1 ± 2,2 % – min: Ningaloo 5,0 ± 0,9 %); Pseudoalteromonadaceae (maximal: Ningaloo 11,5 ± 2,8 % – min: Cancun 4,5 ± 1,2 %) und Pseudomonadaceae (maximal: Cancun 9,8 ± 1,9 % – min: Ningaloo 4,5 ± 0,8 %). Einige Familien zeigten in einer Ansammlung eine hohe relative Häufigkeit von Haien, anderswo jedoch eine geringe Häufigkeit; Beispielsweise hatten Sphingomonadaceae auf den Philippinen einen Mittelwert von 10,5 (± 1,8) % und Pelagibacteraceae einen Mittelwert von 14,6 (± 1,9) % in Ningaloo (Abb. 2a).

Taxonomische Vielfalt und Zusammensetzungsmuster des Mikrobioms bei Walhaien an fünf Standorten. (A) Durchschnittliche Verteilung der 20 am häufigsten vorkommenden Taxa auf Familienebene über alle Standorte hinweg. Die Größe des Punktes entspricht dem relativen Anteil jeder Familie. Das Verhältnis der Punktgröße ist unterhalb der Abbildung angegeben. (B) Taxonomische Alpha-Diversität, gemessen als effektive Anzahl mikrobieller Familien. Punkte über Kästchen zeigen die Verteilung der Diversitätswerte für jeden Standort. Buchstaben entsprechen der Position, deren Vergleich bei p < 0,05 deutlich abweicht. Abbildung A und B teilen sich die Standortbezeichnungen. (C) Taxonomische Mikrobiom-Zusammensetzungsmuster von Walhaien basierend auf der Bray-Curtis-Unähnlichkeit. Jeder Punkt stellt eine metagenomische Stichprobe dar, und die Ellipse zeigt die 95-prozentige Konfidenz für die Stichprobenverteilung an jedem Ort im multivariaten Raum.

Die effektive Diversität auf Familienebene war zwischen den Aggregationen signifikant unterschiedlich (Kruskal-Wallis χ2 df = 4 = 30,02; p < 0,01; Abb. 2b; SI-Tabelle 2), wobei Cancun die geringste Diversität der Mikrobiome aufwies (effektive Diversität; eH`: 20,4 ± 1,21). und Ningaloo am vielfältigsten (47,9 ± 4,25). Auch der Reichtum an Mikrobenfamilien unterschied sich deutlich zwischen den Aggregationen (Kruskal-Wallis χ2 df = 4 = 17,1; p < 0,01; min: La Paz 338 ± 17,6 Familien – max: Tansania 384 ± 4,6 Familien, SI Abb. 2a; SI-Tabelle 3). ) ebenso wie die Gleichmäßigkeit (Kruskal-Wallis χ2 df = 4 = 30,3; p < 0,01; Pielou-Gleichmäßigkeit; min: 0,51 ± 0,01 in Cancun – max: 0,6 ± 0,02 in Ningaloo SI Abb. 2b; SI-Tabelle 4). Daher wirkten sich sowohl die Anzahl der Mikrobenfamilien als auch die relative Häufigkeit jeder Mikrobenfamilie auf die Diversitätsmuster der Mikrobiome über Aggregationen hinweg aus.

Auch die Zusammensetzungsmuster der epidermalen Mikrobiome von Walhaien variierten. Wir haben zunächst die Mikrobiome der Walhaie anhand von Wasserproben getestet, die an jedem Standort gesammelt wurden. Die epidermalen Mikrobiome der Walhaie unterschieden sich von der Wassersäule (PERMANOVA: Pseudo-F df = 1, 79 = 2,43, p < 0,05; R2 = 0,03, SI Abb. 3). Anschließend analysierten wir mehrere Faktoren, um den besten Prädiktor für die Unterschiede in der Zusammensetzung des Mikrobioms zwischen Haien zu ermitteln. Die Aggregation war der stärkste Prädiktor für die Mikrobiomvariation (PERMANOVA: Pseudo-F df = 4,69 = 4,09, p < 0,001; R2 = 0,19; Abb. 2c). Das Meeresbecken, in dem die Walhai-Ansammlung stattfand, war ebenfalls signifikant, jedoch mit geringerer Erklärungskraft (PERMANOVA: Pseudo-F 2,71 = 4,52, p < 0,001; R2 = 0,11). Wir haben zusätzlich die Populationsstruktur von Walhaien getestet, indem wir Standorte anhand etablierter Walhai-Populationsschätzungen16 gruppiert haben, und haben signifikante Gruppierungen gefunden, jedoch mit viel weniger erklärter Variation (PERMANOVA: Pseudo-F 1,72 = 6,55, p < 0,001; R2 = 0,08). , relativ zum Aggregationsfaktor. Eine paarweise PERMANOVA wurde zur Aggregation durchgeführt und zeigte, dass sich die taxonomische Zusammensetzung der Mikrobiome von Cancun-Walhaien von allen anderen Aggregationen unterschied (p < 0,01). Die Mikrobiome der Walhaie in La Paz unterschieden sich von denen der Philippinen und Tansanias (p = 0,04), aber interessanterweise gab es keinen Unterschied zwischen den Mikrobiomen der Walhaie in Tansania, Ningaloo und den Philippinen, die in der Region des Indischen Ozeans vorkommen.

Netzwerkstruktur der mikrobiellen Taxonomie von Walhaien an den vier Standorten, einschließlich der Mikrobiome von Cancun, La Paz, Ningaloo und den Philippinen. (A) Netzwerke wurden mit dem SpiecEasi-Algorithmus berechnet. Netzwerkknoten wurden so ausgerichtet, dass Knoten mit großem Grad (mehr Kanten) zentralisiert sind, während Knoten mit niedrigerem Grad peripher sind. Die Farbe der Knoten stellt den zugewiesenen Cluster dar. (B) Gradverteilung für Mikrobiom-abgeleitete Netzwerke im Vergleich zu modellierten Gradverteilungsmustern. Gradverteilungen für die vom Mikrobiom abgeleiteten Netzwerke sind in Bi-Plots als fette Linie dargestellt, während der schattierte Bereich die geschätzten Dichten von 5000 generierten Erdos-Renyi-Netzwerken darstellt. Die gepunktete vertikale Linie (†) zeigt den mittleren Grad (Anzahl der Kanten) aller Knoten in den Mikrobiom-Netzwerken. Einfügungen in jedem Bi-Plot geben p-Wert-Verteilungen von 5000 Tests an. Die gepunktete Linie innerhalb der p-Wert-Verteilung stellt den Cut-off von 0,05 dar. Zu den Symbolen in der Abbildung gehören: † mittlerer Gradwert des von Walhaien abgeleiteten Netzwerks; * die Anzahl der Knoten im von Walhaien abgeleiteten Netzwerk; ** Modularität für von Walhaien abgeleitete Netzwerke; °untere und obere Modularitätswerte für modellierte Netzwerke.

Um neu auftretende Mikrobiommuster zu bestimmen, wurde die Netzwerkarchitektur in vier der fünf Aggregationen verglichen (Tansania wurde aufgrund der geringen Stichprobengröße ausgeschlossen) (Abb. 3a, b). Die Anzahl der taxonomischen Familien (Knoten) in jedem Netzwerk lag zwischen 101 (Cancun und Ningaloo) und 160 (Philippinen) mit mittleren Knotengraden von 2,1, 2,4, 3,8 und 3,9 (durchschnittliche Anzahl des gleichzeitigen Vorkommens mit anderen mikrobiellen Familien; Ningaloo). , Cancun, Philippinen bzw. La Paz; Abb. 3a). Die Gradverteilungskurven der Mikrobiome an den vier Standorten waren konsistent (Abb. 3b). Da es keine einheitliche Methode für den Vergleich von Netzwerkabständen gibt17 und unser Ziel darin bestand, die statistischen Eigenschaften jedes Netzwerks miteinander zu vergleichen, haben wir Nullmodellvergleiche durchgeführt. Jedes vom Mikrobiom erstellte Netzwerk wurde mit 5.000 Bootstrapping-G(m, n)-Zufallsnetzwerken verglichen, die basierend auf der Anzahl der Knoten und Kanten für jeden Standort generiert wurden (Kolmogorov Smirnov mit zwei Stichproben: p > 0,05 in 19.997 von insgesamt 20.000 Bootstraps; Abb. 3b). Diese Mikrobiomnetzwerke aus allen Aggregationen hatten ähnliche globale Netzwerkmerkmale (dh die Anzahl gleichzeitig variierender Mikrobenfamilien), die jeweils mit denen eines Erdos-Renyi-Netzwerks übereinstimmten. Mit anderen Worten: Jedes Mikrobiom-Netzwerk stimmte mit dem Nullmodellvergleich überein. Interessanterweise zeigte die Subnetzwerkstruktur jedes durch Mikrobiome geschaffenen Netzwerks Modularität, eine Eigenschaft, die zufällige Netzwerke nicht besitzen. Die Modularitätswerte der durch Mikrobiome erstellten Netzwerke (Cancun: 0,70; La Paz: 0,58; Ningaloo: 0,71; Philippinen: 0,60) lagen über der oberen 95 %-Konfidenzschwelle für Modularitätswerte der randomisierten Netzwerke (oberes KI; Cancun: 0,69; La Paz: 0,52; Ningaloo: 0,69; Philippinen: 0,52), was auf einen signifikanten Unterschied hindeutet und somit die zugrunde liegende Gemeinschaftsstruktur in der Mikrobiom-Netzwerktopologie zeigt. Die Modularität weist darauf hin, dass einige Mikrobenfamilien im Vergleich zum Rest der Mikroben stärker mit einer Reihe von Mikrobenfamilien koexistieren und daher Cluster innerhalb des Netzwerks bilden. Jedes Netzwerk hatte etwa 11 Cluster mikrobieller Familien (Cancun – 12; La Paz – 11; Ningaloo – 12; Philippinen – 10). Allerdings war die Familienzugehörigkeit innerhalb eines Clusters nicht standortübergreifend konsistent. Wir haben auch festgestellt, ob die Bedeutung von Mikrobenfamilien, gemessen als Betweenness-Zentralität (solche mit einer größeren Anzahl von Kanten), mit der relativen Häufigkeit der Mikrobenfamilie übereinstimmt (Abb. 4). Interessanterweise korrespondierte die Zunahme der Kantenanzahl nicht mit einer Zunahme der relativen Lesehäufigkeit in jeder Mikrobenfamilie; ein einheitliches Muster an jedem Standort. Daher spielen Mikroben, deren relative Häufigkeit im Mikrobiom gering ist, eine überproportional große Rolle in der Mikrobiomarchitektur, was darauf hindeutet, dass es sich hierbei um Schlüsselarten des Mikrobioms handelt.

Die Verteilung der Betweenness-Zentralitätswerte für jede Mikrobenfamilie, aufgetragen gegen die Anzahl der Kanten für jeden Standort. Die Größe der Symbole entspricht der mittleren relativen Häufigkeit jeder Mikrobenfamilie.

Um die Variation wichtiger Taxa zwischen Wirtsmikrobiomen weiter zu untersuchen, haben wir Metagenome Assembled Genomes (MAGs) konstruiert. Insgesamt wurden 118 MAGs generiert, davon 35 von hoher Qualität mit einer Vollständigkeit von ≥ 70 % und einer Kontamination ≤ 5 % (Abb. 5a, b)18. Es gab 268 Contigs > 50.000 bp und der längste Contig war 430.630 bp. Der Beitrag der Lesevorgänge zu den MAGs war in allen Aggregationen hoch (Philippinen – 64,2 %; Cancun – 54,4 %; Tansania – 38,7 %; La Paz – 28,5 %; Ningaloo – 11,1 %). MAGs wurden fünf Mikrobenklassen zugeordnet, darunter Alpha-, Gamma- und Beta-Proteobakterien; Zytophagie; und Flavobakterien (Abb. 5a). MAG-Bin 39 wurde nur der Proteobakterien-Stammgruppe zugeordnet, während nur ein einziges MAG (Bin 107 – Pseudomonas stutzeri) auf Artenebene annotiert werden konnte, was darauf hindeutet, dass mikrobielle Mitglieder im Walhai-Mikrobiom recht neu sind. Es gab mehrere MAGs, in denen alle Aggregationen gleichermaßen zu Lesevorgängen beitrugen (z. B. Bin 91 – Flavobacteriaceae, Bin 107 – Pseudomonadaceae, Bin 42 – Erythrobacteraceae) und andere, in denen ein einzelner Standort einen größeren Beitrag leistete (z. B. Bin 62; Cancun – Flavobacteriaceae, Bin 100; Cancun – Pseudoalteromonadaceae, Bin 3; Philippinen – Chromatiaceae). Von den 35 MAGs wurden 25 in allen Aggregationen gefunden, während acht in Ningaloo und jeweils zwei in den Philippinen und in Cancun fehlten. Alle 35 MAGs waren in den Walhai-Mikrobiomen von La Paz und Tansania vertreten. Die Familienidentität der MAGs entspricht mehreren der relativ häufigsten Familien, die durch kurze Leseanmerkungen identifiziert wurden, darunter Flavobacteriaceae, Pseudoalteromonadaceae und Pseudomonadaceae. Alteromonadaceae, die am häufigsten vorkommende Familie mit kurzen Lesekommentaren, war in den hochwertigen MAGs nicht vertreten, was darauf hindeutet, dass diese Familie auf Artenebene möglicherweise eine hohe Diversität aufweist, wobei die Artenzahl relativ gering ist.

Die 35 vollständigsten Metagenom-assemblierten Genome (MAGs). (A) Phylogenetische Platzierung von MAGs im Vergleich zu anderen MAGs mit Blattfarbe, die auf die taxonomische Zuordnung auf Klassenebene hinweist. (B) Tabelle und Heatmap enthalten MAG-Statistiken, wobei die Farben dem mittleren relativen Prozentsatz der Lesevorgänge aus Metagenomen an jedem Standort entsprechen, die zu den MAGs beitragen, und der hierarchischen taxonomischen Identifizierung jedes MAG. Die Schattierung der taxonomischen Identität jedes MAG basiert auf Mikrobenklassen. Heatmap wurde mit Pheatmap v. 1.0.12 (https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html) im R-Paket generiert.

Durch die Gruppierung der Genhäufigkeit innerhalb funktioneller Subsysteme wurden fünf Hauptgruppen von MAGs definiert (Abb. 6). Ökogruppe 1 war ein Bacteroidetes-Cluster mit MAGs, die den Flavobacteria- und Cytophagia-Klassen zugeordnet wurden und hauptsächlich bei Walhaien an allen Standorten vorkommen (6 von 9 MAGs). Behälter 7 wurde jedoch in Ningaloo nicht gefunden und die Behälter 1 und 57 wurden in Cancun nicht gefunden. Zu den überrepräsentierten Genfunktionen in der Bacteroidetes-Gruppe gehörten Stickstoff-, Eisenaufnahme-, Aminosäure-, Motilitäts- und Chemotaxisfunktionen, was auf die Rolle dieser Gruppe im Spurennährstoffstoffwechsel schließen lässt. Ökogruppe 2 war vielfältiger, wobei MAGs als Alpha-, Beta-, Gammaproteobakterien und Flavobacteriia identifiziert wurden. Auch hier war die Mehrheit der MAGs in diesem Cluster auf die vier Standorte verteilt (16 von 23 MAGs). Zu den in dieser Gruppe überrepräsentierten Genfunktionen gehörte der Metabolismus aromatischer Verbindungen; Sekretionssysteme vom Typ I, II und III; und Sphingolipide. Der Kohlenstoffstoffwechsel, einschließlich der Nutzung von Mono-, Di- und Oligosacchariden, war ebenfalls überrepräsentiert, was darauf hindeutet, dass diese Gruppe eine Rolle im Kohlenstoffstoffwechsel spielt. Es gab drei MAGs, die nicht geclustert waren, was darauf hindeutet, dass jedes einzelne einzigartige Genfunktionen hatte. MAGs dieser Gruppen wurden als Pelagibacteraceae (Bin 32), Acinetobater-Gattungen (Bin 49) und Pseudomonas sturtzeri (Bin 107) bezeichnet; Jeder Behälter war an allen Standorten vorhanden. Bei Pelagibacterceae waren Housekeeping-Gene wie eine Reihe von Aminosäurestoffwechseln, Kohlenstofftransport und NAD-zu-NADP-Signalwegen überrepräsentiert und es fehlten interessanterweise Photorhodopsin-Gene. Acinetobater wies eine Überrepräsentation von Genen auf, die mit Wirt-Pathogen-Interaktionen, Quorum Sensing, Siderophoren, Multiresistenz-Effluxpumpen, Kohlensäuren und dem Proteinsekretionssystem Typ VI assoziiert sind. Pseudomonas sturtzeri wies eine Überrepräsentation von Genen auf, die am Polysaccharidstoffwechsel, der Stressreaktion, den Multiresistenz-Effluxpumpen, Toxinsystemen, Phosphonaten, Selenoproteinen, Transportergenen und Flagellen für die Motilität beteiligt sind.

Heatmap der 35 hochwertigen MAGs und der relativen Häufigkeit von Genen, die mit bestimmten Stoffwechselfunktionen verbunden sind. Rot weist auf eine höhere Häufigkeit von Genen hin, während Blau auf eine geringere Repräsentation innerhalb jedes funktionellen Subsystems hinweist, das aus der Annotation der MAGs in der PATRIC-Datenbank ermittelt wurde. Die Farben entlang der oberen X-Achse entsprechen der taxonomischen Klasse, die jedem MAG zugewiesen wurde, und die Farben entlang der Y-Achse entsprechen der Oberklasse, zu der jedes Subsystem gehört. Schwarze Punkte entlang der unteren X-Achse stellen die MAGs dar, die an allen Orten gefunden wurden. Heatmap wurde mit Pheatmap v. 1.0.12 (https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html) im R-Paket generiert.

Das Mikrobiom wird zunehmend als mehr als die Summe seiner Teile betrachtet, und hier bestätigen wir diese Ansicht, dass Mikrobiome von einzelnen Gruppen von Walhaien aus der ganzen Welt konsistente architektonische Merkmale des Mikrobioms aufweisen. Wir bestätigen, dass das Muster der entstehenden Architektur unabhängig von der Diversität und Zusammensetzung des Mikrobioms entsteht. Dies deutet auf eine grundlegende Beziehung zwischen dem Wirt und seinem Mikrobiom hin, die eher die mikrobielle Architektur als nur die Diversität moduliert. Eine Störung dieser architektonischen Eigenschaften kann daher ein Frühindikator für Dysbiose oder ungesunde Mikrobiome sein. Darüber hinaus wurden an allen Standorten zwei mikrobielle Ökogruppen identifiziert und als der häufig vorkommende Kern definiert, obwohl einige MAGs nur an einigen Standorten vorkommen. Daher können potenzielle Genfunktionen aus den beiden Ökogruppen dazu beitragen, eine konsistente Netzwerkarchitektur zu stabilisieren oder zu erleichtern, indem sie häufig vorkommende Substrate in den Walhai-Mikrobiomen mineralisieren.

Ähnliche Netzwerkarchitekturen innerhalb des Mikrobioms über Walhai-Ansammlungen hinweg weisen auf Selbstorganisation innerhalb dieser Gemeinschaften und damit auf ähnliche ökologische Nischen hin19, 20. Selbstorganisation ist nicht von der taxonomischen Identität wichtiger Gemeinschaftsmitglieder abhängig (solche mit einer hohen Anzahl vorhergesagter Interaktionen innerhalb der Gemeinschaft). Netzwerk), im Einklang mit den Ergebnissen von Bioreaktorexperimenten, bei denen Kohlenstoffkreislaufaktivitäten aufrechterhalten wurden12. Daher üben die Walhai-Mikrobiome wahrscheinlich an jedem Standort ähnliche Funktionen aus, was auf eine Verbindung mit dem Wirt schließen lässt. Darüber hinaus ist die Netzwerkarchitektur von Natur aus hierarchisch11, sodass die Charakterisierung von Attributen der Netzwerkebenen, einschließlich der gesamten Netzwerk-, Subnetzwerk- und Knotenebene, ökologische Veränderungen in der Mikrobiomfunktion aufzeigt. Beispielsweise nahm die Netzwerkkomplexität der Bodenmikrobengemeinschaften mit zunehmender Anbauintensität ab21 und Rhizosphärennetzwerke wurden mit zunehmender Reife der Pflanzen organisierter und komplexer22. Daher lässt die Konsistenz der Mikrobiomnetzwerke von Walhaien, unabhängig vom Standort, darauf schließen, dass ähnliche ökologische Prozesse die epidermalen Mikrobiome des größten Hais der Welt formen; Möglicherweise handelt es sich um ein Phänomen, das durch ein Wirtsmerkmal ausgelöst wird, beispielsweise durch die Filterwirkung des von der Epidermisoberfläche und/oder der dermalen Zähnchen abgesonderten Schleims23.

Komplexe Mikrobiome bilden sich kreuzende Netzwerke, von denen erwartet wird, dass sie die Subnetzwerkstruktur vermitteln, beispielsweise die Modularität24. Walhaie der verschiedenen Ansammlungen wiesen trotz der unterschiedlichen geografischen Standorte durchweg eine Modularität oder Subnetzwerkstruktur des epidermalen Mikrobioms auf. Modularität deutet auf eine Nischendifferenzierung hin, die aus einer starken Selektion resultiert, etwa durch Wirtsfilterung25 oder Mikroben-Mikroben-Interaktionen in Form von Kooperation und/oder Konkurrenz12. Darüber hinaus zeigten Netzwerke, dass wichtige mikrobielle Familien, definiert als solche mit vielen Wechselwirkungen, nur in geringer Häufigkeit vorkommen. In Bioreaktor-Experimenten stabilisierten sich die mikrobiellen Gemeinschaften, die Gemeinschaft wurde stark vernetzt und Keystone-Mikroben (stark vernetzte Mikroben) waren nur noch in geringer Häufigkeit vorhanden8. Obwohl die Rolle der Schlüsselsteine nicht explizit untersucht wurde, gehen wir davon aus, dass diese Gruppe durch die Durchführung spezialisierter Stoffwechselprozesse einen unverhältnismäßig großen Einfluss auf die Gesamtstruktur der Gemeinschaft hat26. Experimentelle Beweise aus einer multiplikativen Gemeinschaftskultur zeigten, dass Schlüsselmikroben über einen speziellen Stoffwechsel verfügten, einschließlich des Zellulose- und Chitinabbaus, deren Nutzung als Energiequelle jeweils metabolisch teuer war27. Daher sind Mikroben, die die Schlüsselposition einnehmen, für die Netzwerkstruktur von entscheidender Bedeutung, und weitere Untersuchungen werden die Rolle dieser Mikroben im epidermalen Mikrobiom des Walhais enthüllen.

Der reichlich vorhandene Kern wurde durch Zusammenfügen der einzelnen Lesevorgänge zu Metagenome Assembled Genomes (MAGs) identifiziert. Die Anzahl der in unserer Studie charakterisierten MAGs (35 von hoher Qualität) war ähnlich wie in zwei anderen Studien, die sich auf Hai-Mikrobiome konzentrierten, eine, in der 54 MAGs von hoher/mittlerer Qualität auf der Hautoberfläche von Leopardenhaien (Triakis semifasciata) gefunden wurden28 und eine andere, in der 27 gefunden wurden MAGs aus Kotproben von zwei Haiarten29. Diese reichlich vorhandenen Kernmikroben unterstützen möglicherweise die Architekturmuster des Mikrobioms, indem sie Stoffwechselprozesse bereitstellen. Beispielsweise trieben zahlreiche mikrobielle Gruppen, die aus natürlichen, mit Regenwasser gefüllten Baumlöchern kultiviert wurden, Hauptprozesse an, darunter Atmung, Stoffwechselpotenzial und Zellertrag der gesamten Gemeinschaft27. Der reichlich vorhandene Kern des Walhai-Mikrobioms wurde basierend auf dem Vorhandensein potenzieller genfunktionaler Subsysteme weiter in zwei Ökogruppen unterteilt. MAGs innerhalb der beiden Ökogruppen weisen an den Probenstandorten Unterschiede in ihrer Häufigkeit auf, was die in den Netzwerken beobachteten Ergebnisse unterstützt, dass wichtige mikrobielle Gruppen nicht dieselben taxonomischen Gruppen sein müssen und dass funktionale Redundanz auftritt. Ökogruppe 1 bestand aus neun MAGs, die als Flavobacteriia- und Cytophagia-Mikroben identifiziert wurden. Interessanterweise sind Mikroben dieser taxonomischen Gruppen häufig mit Fischschleim-Mikrobiomen assoziiert30 und könnten auf eine ähnliche Rolle im epidermalen Mikrobiom hinweisen. Flavobacteracaea MAGs wurden im epidermalen Mikrobiom des Leopardenhais (T. semifasciata)28 gefunden, was darauf hindeutet, dass es sich bei dieser Mikrobenfamilie um einen Symbionten von Meeresfischen (Knochen- und Knorpelfische) handelt. Genpfade in Ökogruppe 1 unterstützen die Rolle dieser Gruppe als Hautmikrobiom-Symbionten, die Schleim nutzen. Schleim, der bei Fischen auf die Hautoberfläche abgesondert wird31, besteht aus bürstenartigen Fasern, die aus Glykoprotein-Rückgraten gebildet werden, die mit O-verknüpften Aminosäuren bedeckt sind, die reich an essentiellen Nährstoffen sind, die für die mikrobielle Aktivität notwendig sind, einschließlich Schwefel, Stickstoff und Phosphor32. MAGs der Ökogruppe 1 wurden von MAGs der Ökogruppe 2 durch das Vorhandensein von Genwegen zur Mineralisierung der in dieser Umgebung reichlich vorkommenden Aminosäuren unterschieden. Es wurde gezeigt, dass die experimentelle Anreicherung von Meerwasser mit Fischschleim eine schnelle mikrobielle Mineralisierung auslöst, was durch einen schnellen Anstieg des Ammoniums33 belegt wird, was die mikrobielle Reaktion auf die Bestandteile des Schleims verdeutlicht. Ökogruppe 1 wies auch eine Überrepräsentation von Genen auf, die mit Motilität und Chemotaxis in Verbindung stehen, was darauf hindeutet, dass diese Gruppe für die physische Etablierung der mikrobiellen Gemeinschaft wichtig ist, wie in Pflanzen-Wurzel-Systemen34 und Korallenschleim35 zu sehen ist. Chemotaxis kann von Mikroben auch genutzt werden, um die Hemmwirkung der physikalischen Muster zu überwinden, die von dermalen Dentikeln der Elasmobranchier erzeugt werden. In modellierten Systemen reduzierte die Oberflächentopographie der Hai-Epidermis die Biofilmbildung medizinisch relevanter mikrobieller Gruppen36. Darüber hinaus produzieren zwei als Algoriphagus identifizierte MAGs (Bin 77 und 56) Lipide, die die Entwicklung von Choanoflagellaten hemmen37, was auf eine mögliche Rolle bei der Hemmung oder Konkurrenz mit Mikroeukaryoten und anderen mikrobiellen Gruppen um den Weltraum hinweist. Wir gehen davon aus, dass Flavobacteriia und Cytophagia wichtige Mitglieder des Mikrobioms sind, da sie an allen Standorten gefunden wurden.

Die Mikroben der Ökogruppe 2 waren vielfältiger und hatten 25 MAGs, die als Alpha-, Beta- und Gammaproteobakterien identifiziert wurden; und Flavobakterien. Das in dieser Ökogruppe vorhandene Gen-Subsystem war ebenfalls sehr vielfältig und weist darauf hin, dass Mikroben die Mikroben-Wirt- und/oder Mikroben-Mikroben-Interaktionen vorantreiben und kürzere Zuckeroligomere für die Kreuzfütterung verfügbar machen. Beispielsweise deutet die Überrepräsentation von Genklassen, die mit dem Metabolismus aromatischer Verbindungen, Sekretionssystemen vom Typ I, II und III38 und Sphingolipiden39 verbunden sind, darauf hin, dass Mikroben mit der Umgebung interagieren und Wirtssubstrate nutzen. Interessanterweise wurde vermutet, dass Spingolipide mit Rezeptoren auf der Haut von Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) interagieren, um die Homöostase der Schleimhaut zu modulieren40, was möglicherweise darauf hindeutet, dass die Alphaproteobakterien, aus denen die Sphingolipid-Gene identifiziert wurden, eine ähnliche Rolle in der Haut von Walhaien spielen könnten und dabei helfen, die Haut zu modulieren Schleim. Spingolipide wurden über einen Zeitraum von drei Jahren auch im epidermalen Mikrobiom von Leopardenhaien (Triakis semifasciata) identifiziert41, sodass Spongolipide möglicherweise ein wichtiges Mitglied des epidermalen Mikrobioms von Elasmobranchen sind. Darüber hinaus deutet das Vorhandensein von Genunterklassen, die die Kohlenstoffverwertung und Exopolymerverbindungen repräsentieren, einschließlich Polydi- und Oligosaccharid-Metabolismen, auf eine mukolytische Fähigkeit zur Energiegewinnung und Freisetzung anderer limitierender Nährstoffe im Schleim hin. MAGs, die aus der epidermalen Oberfläche zweier Stachelrochenarten (Myliobatis californica und Urobatis halleri) hergestellt wurden, enthielten Wege für den Abbau langkettiger Kohlenstoffe (d. h. Polysaccharide)42, was darauf hindeutet, dass dies ein häufiger Weg unter Mitgliedern des epidermalen Mikrobioms der Elasmobranchiere ist.

Die drei anderen MAGs, die nicht zur Ökogruppe 1 oder 2 gehörten, besaßen jeweils sehr unterschiedliche Gensubsysteme. Am bemerkenswertesten ist die Pelagibacteraceae MAG (Bin 32), die an jedem Standort gefunden wurde und eine häufige pelagische Mikrobengruppe darstellt43 und daher möglicherweise eine Kontamination durch die umgebende Wassersäule darstellt. Pelagibacteraceae kommen jedoch im epidermalen Mikrobiom von Schwarzspitzen-Riffhaien (Carcharhinus melanopterus)44 und im Korallenschleim-Mikrobiom45 vor und könnten daher ein Bewohner des Walhai-Mikrobioms sein.

Diversität und Zusammensetzungsstruktur liefern Einblicke in die Ökologie von Walhaien, da das epidermale Wirtsmikrobiom am besten durch die Ansammlung von Walhaien vorhergesagt werden konnte, was möglicherweise eine Umweltsignatur aufdeckt. Die epidermale Oberfläche von Walhaien bleibt in Kontakt mit der Wassersäule, die selbst eine bestimmte mikrobielle Gemeinschaft23 beherbergt und als Umweltreservoir oder regionaler Pool potenzieller mikrobieller Besiedler dient. Die mikrobiellen Gemeinschaften der Walhaie unterschieden sich von den mikrobiellen Gemeinschaften der Wassersäule, ähnlich wie bei anderen Hai-Mikrobiomen23. Allerdings setzen Walhaie aufgrund ihres Bewegungsverhaltens ihre Hautoberfläche regelmäßig extremen Umwelteinflüssen aus. Im Golf von Mexiko beispielsweise bewegen sich Walhaie bis zu 52,3 km/Tag46 und tauchen in große Tiefen, wodurch die Mikroben Temperaturen von 30 °C an der Oberfläche bis 4 °C in der Tiefe ausgesetzt werden47, 48. Mikrobiom-Diversitätsmuster bei Walhaien können auch durch inhärente Aggregationseffekte einschließlich der Ernährung beeinflusst werden, wie es bei anderen Fischarten zu beobachten ist49. Walhaie auf den Philippinen50 und in Tansania51 fressen hauptsächlich Sergestidengarnelen, während Walhaie in La Paz sich von Copepodenblüten ernähren52 und die Ansammlung in der Nähe von Cancun Fischeier frisst53. Die genetische Struktur war auch ein mäßiger Prädiktor für die Mikrobiomstruktur. Walhaie haben aufgrund der Genetik zwei abgeleitete Populationen54: eine atlantische und eine indopazifische Gruppe. Treiber des Mikrobioms auf Populationsebene können auf inhärente Wirts-Stoffwechselunterschiede oder auf Faktoren zurückzuführen sein, die mit der Walhaipopulation kovariieren, wie beispielsweise die von den Haien genutzten globalen Regionen, wie oben erläutert. Studien an anderen Meeresarten zeigen Mikrobiomzusammensetzungen, die der Struktur der Wirtspopulation entsprechen, beispielsweise bei einigen Schwämmen55, und der Variation der Haplotypstruktur innerhalb der Populationen, beispielsweise beim Phytoplankton Thalassiosira rotula56. Walhaie haben verschiedene Haplotypstrukturen57, die ein wichtiger Prädiktor für das Mikrobiom sein können Struktur, die über Aggregationen hinweg beobachtet wird, wir haben diese Beziehung hier jedoch nicht getestet.

Zusammenfassend haben wir die grundlegende Architektur des epidermalen Mikrobioms von Walhaien aus allen Weltmeeren identifiziert. Unsere Ergebnisse liefern Hinweise auf einen inhärenten Montageprozess, der durch die Diversität des Mikrobioms allein nicht aufgedeckt werden konnte. Durch die Charakterisierung grundlegender Mikrobiommuster des Walhais, einem Mitglied der ältesten existierenden Gruppe von Wirbeltieren, enthüllen wir eine neu entstehende Mikrobiomstruktur, die möglicherweise in allen Wirbeltierorganismen, einschließlich des menschlichen Wirts, allgegenwärtig ist. Somit bietet die Mikrobiomarchitektur einen Maßstab für die Untersuchung gesunder Mikrobiomstrukturen und ermöglicht es, die zugrunde liegenden Mikrobiom-Wirt-Beziehungen aufzudecken. Die Diversitätsstruktur des Mikrobioms hingegen ist aussagekräftiger für die Identifizierung ökologischer Aspekte von Anpassungen als Reaktion auf plastische Eigenschaften des Wirts, wie z. B. Umwelt oder Ernährung. Darüber hinaus entstanden zwei Ökogruppen, die darauf hindeuten, dass im reichlich vorhandenen Kernmikrobiom zwei ökologische Nischen vorkommen, und diese Gruppen könnten Energie für andere mikrobielle Gruppen liefern, beispielsweise für Schlusssteine, die die Mikrobiomarchitektur unterstützen. Die MAGs wurden als mikrobielle Gruppen identifiziert, die häufig im Hautmikrobiom von Knochenfischen vorkommen. Es konnte jedoch nur eine auf Artebene identifiziert werden, was darauf hindeutet, dass neuartige mikrobielle Arten eine ökologisch wichtige und reichlich vorhandene Kernnische im Walhai-Mikrobiom besetzen.

Mikrobiome wurden aus der Epidermis von 74 einzelnen Walhaien an mehreren Standorten weltweit untersucht (Abb. 1). Im Zeitraum 2017–2018 wurden fünf Ansammlungen beprobt, darunter 14 Walhaie aus La Paz (24°18′31,5′′ N; 110°37′42,5′′ W) im Februar 2017; 19 aus Cancun, Mexiko (21°23′49,59′′ N; 86°37′24,16′′ W) im Juli 2017; sechs von Mafia Island, Tansania (7°52′56,67′′ S 39°39′22,35′′ E) im November 2017; 16 vom Ningaloo Reef, Australien (22° 04′32,78′′ S; 113°39′06,26′′ E) im Juni 2018; und 19 aus Oslob, Philippinen (9°30′32,3 N; 123°25′01,8) im Juli 2018. Die geringe Anzahl an Proben aus Tansania war darauf zurückzuführen, dass sich die Haie später als vorhergesagt ansammelten. Mikrobiome wurden von der Epidermisoberfläche entlang der dorsolateralen Oberfläche in Linie mit der ersten Rückenflosse entnommen (Abb. 1). Die Proben wurden mit einer Zwei-Wege-Spritze gesammelt, die gefiltertes Meerwasser (0,02-µm-Filter) über die Hautoberfläche zirkulieren lässt, bevor es in die Rückseite der Spritze gesaugt wird58, 59. Dieses Verfahren ermöglicht die Probenahme von Mikroben aus untergetauchten Walhaien bei gleichzeitiger Minimierung des Meerwassers Mikrobiom-Kontamination. Von jedem Hai nahmen wir vier Spritzen, was ungefähr 180 ml Probenwasser ergab, das dann durch einen 0,22 µm großen Sterivex-Filter (Millipore, USA) geleitet wurde, wobei das gesamte mikrobielle Leben auf dem Filter eingefangen wurde. Sterivex-Filter wurden mit Parafilm versiegelt und bis zur Langzeitlagerung bei –20 °C auf Eis gelagert. Epidermale Mikrobiome standen im Mittelpunkt der Forschung, da sie minimal invasiv sind und ein spezifischer Bereich des Hais untersucht wurde, der es den Haien ermöglichte, mit minimaler Unterbrechung weiter zu fressen/schwimmen. Der Umgang mit Tieren und die Ethik wurden an der San Diego State University durch IACUC unter den Genehmigungen APF Nr. 14-05-011D, APF Nr. 17-11-010D und APF Nr. 18-05-007D überprüft und alle Methoden wurden gemäß den IACUC-Genehmigungen durchgeführt.

Genomisches Material wurde direkt aus Sterivex-Filtern unter Verwendung eines modifizierten Spin-Säulen-Reinigungsprotokolls aus dem Nucleospin Tissue Kit (Macherey-Nagel, Allentown, PA, USA) extrahiert. Die Modifikation des Extraktionsverfahrens umfasste zunächst die Inkubation versiegelter Sterivex-Filter mit 720 µl T1-Puffer und 90 µl Proteinase K (2,5 mg/ml) bei 55 °C und Rotation über Nacht. Die anschließende Extraktion folgte dem Herstellerprotokoll. Die DNA wurde für die Sequenzierung unter Verwendung des Accel-NGS 2s Plus DNA-Kits (Swift Biosciences, Ann Arbor, MI, USA) für die Paired-End-Sequenzierung mit den Illumina MiSeq v3 600-Zyklen (San Diego, CA, USA) vorbereitet. Die Proben wurden mit einem Barcode versehen und die Walhai-Mikrobiome wurden mit einer Reihe von Mikrobiomproben (z. B. Kelp-, Fisch-, Rochen- und Seegras-Mikrobiomproben) gemischt und von den Studenten des Kurses für ökologische Metagenomik der San Diego State University in mehreren Sequenzierungsläufen getestet.60

Die 74 rohen Fastq-Dateien wurden zunächst mit PRINSEQ61 einer Qualitätskontrolle unterzogen, wobei die Parameter so eingestellt waren, dass sie Lesevorgänge mit einer Mindestlänge von 100 Basenpaaren beibehalten, keine mehrdeutigen Basen (N), einen Mindestqualitätswert von 20 und keine exakten Duplikate aufweisen. Nach der Qualitätskontrolle blieben durchschnittlich 86,4 ± 0,8 % der Messwerte erhalten. Es wurden nur Vorwärtslesevorgänge mit Anmerkungen versehen, um Anmerkungen zur Taxonomie und Genfunktion zu generieren. Die taxonomische Identität wurde mithilfe von Focus62 zugewiesen, einem Tool, das für die schnelle Annotation entwickelt wurde, indem aus metagenomischen Lesevorgängen berechnete k-mer-Profile mit vorberechneten k-mer-Profilen von Referenzdatenbankgenomen abgeglichen werden (Datum der Referenzgenomdatenbank: 2018).

Es wurden Netzwerke aufgebaut, um die mikrobielle Familienarchitektur des epidermalen Mikrobioms von Walhaien aus verschiedenen Ansammlungen zu untersuchen. Netzwerke versuchen, Koexistenzmuster basierend auf den Häufigkeitsverhältnissen von Organismen in einer Gemeinschaft zu rekonstruieren. Die Architektur der Netzwerke basiert auf der Verteilung der Anzahl der angeschlossenen Mitglieder (Gradverteilung) und der Bildung dieser Mitglieder in Gruppen (Modularität)63. Metagenomische Proben sind zusammengesetzt und leiden unter einer geringen Probengröße im Verhältnis zur Anzahl der gleichzeitigen Vorkommen (d. h. Kovariation von Spezies 1 zu Spezies 2). Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir Netzwerke mit dem SpiecEasi-Algorithmus (Version 1.0.7)64 erstellt kombiniert für Kompositionswerte spezifische Transformationen und ein zugrunde liegendes grafisches Modell, das spärliche Daten voraussetzt. Aufgrund der großen Anzahl seltener mikrobieller Gruppen, die den Datensätzen der metagenomischen Gemeinschaft innewohnen, haben wir Taxa entfernt, die über alle Metagenome hinweg weniger als durchschnittlich 100 Gesamtlesungen aufwiesen. Die Netzwerkanalyse reagiert empfindlich auf die Stichprobengröße. Daher haben wir die Tansania-Proben ausgeschlossen (n = 6). Die Parameterwerte für die SpiecEasi-Pipeline waren „mb“, 150 und 5e-2 für das Nachbarschaftsinferenzschema, nlambda bzw. lamda.min.ratio. Diese Werte wurden ausgewählt, um die Netzwerkstabilität zu maximieren (0,05 gemäß SpiecEasi-Empfehlung) und mithilfe der getStability-Funktion im SpiecEasi-Paket ermittelt. Die resultierenden Adjazenzmatrizen wurden mit der adj2igraph-Funktion im SpiecEasi-Paket in igraph-Objekte konvertiert. Netzwerkvisualisierungen wurden in Gephi 0.9.2 durchgeführt und die Analyse wurde mit dem Python-Paket networkx (2.6) durchgeführt, wobei vor der Berechnung des Modularitätswerts eine Community-Erkennung mit Clauset-Newman-Moore-Modularitätsmaximierung65 durchgeführt wurde. Um festzustellen, ob die Netzwerkstatistiken (z. B. Modularität) durch die Gradverteilungen oder kleinere Skalenstrukturen im Diagramm bestimmt wurden, haben wir für jedes empirische Netzwerk (vier Standorte) 5000 graderhaltende Randomisierungen gebootstrappt und dieselben Statistiken berechnet, um deren Mittelwerte und Werte zu ermitteln Konfidenzintervalle innerhalb der Zufallsensembles.

Wir haben festgestellt, ob die Netzwerkgradverteilungen zu klassischen generativen Modellen von Erdos-Renyi (auch als Zufallsnetzwerk bezeichnet) oder zu skalenfreien Netzwerken passen. Ein Netzwerk wird als Erdos-Renyi betrachtet, wenn eine Kante mit gleicher Wahrscheinlichkeit zwei beliebige Knoten verbindet, oder als frei skalierbar, wenn die meisten Knoten nicht stark verbunden sind, es aber „Hubs“ gibt, an denen ein einzelner Knoten mit vielen anderen verbunden ist, wodurch eine Potenzgesetz-Gradverteilung entsteht66 . Um die empirischen Gradverteilungen mit einem generativen Nullmodell zu vergleichen, haben wir daher für jede Aggregation 5000 \(G(m,n)\) Zufallsgraphen mit \(m\) Knoten und \(n\) Kanten wie folgt abgetastet das empirische Netzwerk; Die 5000 Netzwerke werden gleichmäßig zufällig aus der Menge aller möglichen \(G(m,n)\)-Graphen gezogen. Kolmogorov-Smirnov-Tests mit zwei Stichproben zwischen der Gradverteilung des empirischen und des zufälligen Ensemble-Netzwerks wurden verwendet, um eine p-Wert-Verteilung zu generieren, um die Nullhypothese zu akzeptieren oder abzulehnen, dass die Gradverteilung des empirischen Netzwerks mit einem \(G(m,n)\ übereinstimmt. ) Zufallsgraph. Beachten Sie, dass die Eigenschaften von \(G(m,n)\)-Zufallsgraphen in diesem Fall denen von \(G(n,p)\)-Zufallsgraphen ziemlich ähnlich sind, da wir \(m\ approx \left(\ genfrac{}{}{0pt}{}{n}{2}\right)p\), wobei \(p\simeq 0,025\). Ein Jupyter-Notebook, das die Netzwerkanalyse implementiert, ist verfügbar unter: https://github.com/jcmckerral/whalesharknetworks

Um zu untersuchen, ob Walhaie trotz der großen geografischen Trennung zwischen den Ansammlungen über ein Kernmikrobiom verfügen, wurden Metagenom-assemblierte Genome (MAGs) aus den Vorwärts- und Rückwärtsablesungen der 74 Metagenome konstruiert67. Kurz gesagt, die R1- und R2-Lesevorgänge wurden zur Zusammenstellung in Contigs verkettet und die Qualität der Zusammenstellung überprüft. Anschließend wurden die Contigs in Gruppen eingeteilt und die Qualität jedes einzelnen MAG mithilfe von CheckM68,69 auf Vollständigkeit und Kontamination überprüft. Die Messwerte jeder Probe wurden dann auf jedes MAG zurückgeführt, um zu ermitteln, wie jede Probe zur MAG-Konstruktion beigetragen hat. Die Taxonomie der MAGs und MAG-Genfunktionen wurden mit PATRIC Version 3.6.9 unter Verwendung des RAST-Toolkits (RASTtk)70 identifiziert.

Metagenome wurden mithilfe der proportionalen Häufigkeit verglichen, einem robusteren Ansatz zur Verdünnung71. Die Alpha-Diversität wurde anhand mehrerer Metriken verglichen, um zu bewerten, wie Fülle und Reichtum die Diversitätsmuster beeinflussten. Die Reichhaltigkeit (S) wurde als Gesamtzahl der in jeder Stichprobe gefundenen Familien und die Gleichmäßigkeit als Quotient aus Shannons Index (H`) und S berechnet, jeweils berechnet in Vegan Version 2.5.7 mit der Diversitätsfunktion. Die effektive Diversität wurde über die Proben hinweg als e(H`)72 berechnet. Die Diversitätsverteilung wurde über Aggregationen hinweg mit dem nichtparametrischen Kruskal-Test mit paarweisen Dunn-Tests unter Verwendung der dunn.test-Funktion mit kw = TRUE im Paket dunn.test Version 1.3.5 verglichen.

Unähnlichkeitsmatrizen wurden mit der vegdist-Funktion aus dem Vegan-Paket generiert, mit method = 'bray' für die Bray-Curtis-Unähnlichkeit, um Unterschiede in der Zusammensetzung taxonomischer Familienebene über Aggregationen hinweg zu testen. Die MDS-Ordination wurde verwendet, um Beta-Diversitätsmuster und Permutations-Anova (PERMANOVA) zu visualisieren, um Zusammensetzungsmuster über Aggregationen hinweg mithilfe der Adonis2-Funktion mit Standardeinstellungen zu bewerten73. Mikrobiome wurden mithilfe von drei unabhängigen Tests bewertet, die Aggregation (n = 5), Ozean (n = 3) und Population (n = 2) umfassten. Die paarweise permutationelle Anova wurde mit dem Paket pairwiseAdonis (Version 0.0.1) und der Funktion pairwiseadonis durchgeführt. Alle Visualisierungen wurden mit dem GGplot-Paket (Version 3.3.3) oder dem Pheatmap-Paket (Version 1.0.12) durchgeführt. Alle Analysen wurden mit R Version 3.6.0 durchgeführt. Der Code ist unter https://github.com/mpdoane2/whaleshark_analysis frei verfügbar.

Der Umgang mit Tieren und die Ethik wurden an der San Diego State University durch IACUC unter den Genehmigungen APF Nr. 14-05-011D, APF Nr. 17-11-010D und APF Nr. 18-05-007D überprüft.

Die für dieses Projekt generierten metagenomischen Rohdatensätze sind unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA808622 verfügbar.

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Wir möchten Stephanie Lo und Ben Billings Global Shark Research and Conservation Fund danken. Die Feldarbeit in Tansania wurde von Aqua-Firma, WWF Tanzania, der Shark Foundation, Waterlust und zwei privaten Stiftungen unterstützt, und wir danken Mathias Igulu, Paul Kugopya, Liberatus Mokoki und Carlos Omari für ihre Hilfe bei der Feldlogistik. Auf den Philippinen möchten wir außerdem der Tan-awan Oslob Sea Warden and Fishermen Association (TOSWFA) für ihre Unterstützung bei diesem Projekt und die Erleichterung unserer Arbeit danken. Das Projekt wurde mit Genehmigung der Gemeinde Oslob durchgeführt, ordnungsgemäß vertreten durch Hon. Bürgermeister Jon Tumulak, durch eine vorherige Einverständniserklärung. Der Export von Wasserproben von den Philippinen erfolgte mit der Exportgenehmigung BFAR-7 n des Bureau of Fisheries and Aquatic Resources – Region 7 – Department of Agriculture, Cebu City, Philippinen. Probenahmen in Cancun und La Paz erfolgten mit der Genehmigung 03362 der Secretaria de Medio Ambiennte Y Recursoso Naturales.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Michael P. Doane und Michael B. Reed.

Flinders University, Bedford Park, SA, Australien

Michael P. Doane, Jody McKerral, Bhavya Papudeshi, Robert A. Edwards und Elizabeth A. Dinsdale

North Carolina Agricultural and Technical State University, Greensboro, NC, USA

Michael B. Reed

San Diego State University, San Diego, Kalifornien, USA

Laís Farias Oliveira Lima, Asha Z. Goodman, Taylor Dillon, Meredith Peterson und Maria Mora

Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, Kalifornien, USA

Megan Morris

Hopkins Marine Station, Fachbereich Biologie, Stanford University, Pacific Grove, CA, USA

Shaili Johri

Australisches Zentrum für Ökogenomik, University of Queensland, St. Lucia, Queensland, Australien

Abigail C. Turnlund

Ch'ooj Ajauil AC, Cancún, Centro, Mexiko

Rafael de la Parra Venegas

CSIRO, Brisbane, Australien

Richard Pillans

Marine Megafauna Foundation, West Palm Beach, FL, USA

Christoph A. Rohner & Simon J. Pierce

Abteilung für Bio- und Umweltwissenschaften, Universität Katar, Doha, Katar

Gonzalo Araujo

Marine Research and Conservation Foundation, Lydeard St Lawrence, Somerset, Großbritannien

Gonzalo Araujo

Walhai Mexiko von Conciencia Mexiko, La Paz, Baja California Sur, Mexiko

Deni Ramirez-Macias

Unabhängiger Forscher, Quezon City, Philippinen

Christine G. Legaspi

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MD und ED konzipierten das Projektdesign. MR führte die Netzwerkanalyse durch. Von MD und MR verfasstes Manuskript. RE und BP lieferten bioinformatische Analysen. MD, ED, MR, LFOL, JM führten eine Datenanalyse durch. MD, ED, SP, CR, DR, RP, CL, GA, RPV, RE, MP, AT, TD halfen bei der Probenentnahme und erleichterten Aktivitäten vor Ort. Alle Autoren helfen bei der Interpretation der Ergebnisse, geben Feedback und genehmigen das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Michael P. Doane oder Elizabeth A. Dinsdale.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Doane, MP, Reed, MB, McKerral, J. et al. Aufkommende Gemeinschaftsarchitektur trotz ausgeprägter Diversität im globalen epidermalen Mikrobiom des Walhais (Rhincodon typus). Sci Rep 13, 12747 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39184-5

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Eingegangen: 18. Oktober 2022

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39184-5

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